Efeitos in vitro de Natrum muriaticum nas linhagens renais MDCK e LLC-PK1K1 / In Vitro Effects of Natrum muriaticum in Kidney Cell Lines MDCK and LLC-PK1

Trabalhos prévios têm indicado que soluções homeopáticas modificam os aspectos celulares e bioquímicos de células mantidas em cultura. No presente estudo, os efeitos de Natrum muriaticum, medicamento usado na clínica homeopática para o tratamento de hipertensão, foram avaliados em células renais das linhagens MDCK e LLC-PK1. Os seguintes parâmetros celulares foram analisados: viabilidade, morfologia e expressão da (Na+-K+)-ATPase e dos receptores AT1 e AT2 da angiotensina II. As linhagens celulares foram plaqueadas (5,0 x 104 células/mL) em DMEM suplementado com 10% de soro fetal bovino (SFB). Após 24 horas a 37°C, o meio DMEM foi substituído com a adição de 10% (v/v) e 1% (v/v) das seguintes amostras: Natrum muriaticum 30CH, água dinamizada 30CH e água destilada estéril, para a medida de viabilidade celular por MTT. As absorbâncias quantificadas em leitor de ELISA (490 nm) foram comparadas entre si e com os valores obtidos com o grupo controle (células isentas de tratamento) Os valores obtidos de quatro experimentos independentes realizados em quintuplicata foram tabulados e analisados estatisticamente pelo Software Sigma Plot v.11 (Jandel Scientific). A morfologia das células MDCK foi avaliada por microscópio óptico após coloração de Giemsa e a expressão da (Na+-K+)-ATPase e AT1/AT2 de células LLC-PK1 por Western Blot (WB). Para ambos experimentos, 5,0 x 104 células/mL foram incubadas em DMEM suplementado com 10% SFB sendo o meio de cultura diariamente substituído por um novo, contendo 1% de Natrum muriaticum 30CH e água dinamizada 30CH, por 5, 10 e 15 dias. A quantificação de proteínas totais foi realizada pelo método de Lowry, após lise celular. As amostras foram analisadas por eletroforese em SDS-PAGE (12%) e transferidos para membrana de nitrocelulose. Esta membrana foi incubada com anticorpos específicos primário (anti-(Na+-K+)-ATPase, anti-AT1 e AT2 ou anti-anti-beta-actina). A detecção foi realizada utilizando o sistema ECL e Hyperfilm. Os ensaios de MTT mostraram uma redução estatisticamente significativa na atividade mitocondrial celular (p <0,001), indicando um efeito osmótico decorrente da incubação com as soluções teste na concentração de 10% (v/v) Não foram detectadas alterações morfológicas significativas quando ambas as linhagens foram submetidas aos diferentes tratamentos . A análise por WB indicou um aumento proporcional da quantidade (Na+-K+)-ATPase expressa na linhagem LLC-PK1 em função do número de estímulos homeopáticos aplicado. Embora preliminares estes resultados evidenciam, pela primeira vez, que o estímulo homeopático parece modificar a expressão de importantes marcadores fisiológicos da linhagem LLC-PK1 que estão diretamente envolvidos na gênese da hipertensão arterial.(AU)

Previous papers have indicated that homeopathic solutions modify the cellular and biochemical aspects of cells maintained in culture. In this study, the effects of Natrum muriaticum, a medicine used in the homeopathic clinic for the treatment of hypertension, were evaluated in kidney MDCK and LLC-PK1 cell lines. The following cellular parameters were analyzed: viability, morphology and expression of the (Na+-K+)-ATPase and the angiotensin II receptors AT1 and AT2. The cell lines were plated (5.0 x 104 cells/mL) in DMEM supplemented with 10% fetal calf serum (FCS). After 24 hours at 37°C, DMEM was re-fed with the addition of 10% (V/V) and 1% (V/V) of the following samples: Natrum muriaticum 30CH, water 30CH and non-dynamized sterile distilled water to do the MTT assay. The results obtained from these groups were compared to those obtained by incubation of the cells in culture medium free of these solutions (Control). Cell viability was assessed by a colorimetric MTT ELISA assay (490nm). The values from four independent experiments performed in quintuplicate were plotted and statistically analyzed by Sigma Plot v.11 (Jandel Scientific). The morphology of MDCK cells was evaluated by optical microscope after Giemsa?s staining. The expression of the (Na++K+)-ATPase and AT1/AT2 of LLC-PK1 cells was evaluated by Western Blot (WB) analysis. For this experimental set, 5.0x104 cells/mL were incubated in DMEM supplemented with 10% FCS and daily culture medium was replaced by a new one, containing: Natrum muriaticum 30CH and water 30CH. Additionally, cells were treated for 5, 10 and 15 days with 1% of specific solutions and the total protein was measured by the Lowry method, after cell lysis. The samples were analyzed by electrophoresis in SDS-PAGE (12% gel) and transferred to nitrocellulose membrane. This membrane was incubated with specific primary antibodies (anti-(Na++K+)-ATPase, anti-AT1 and AT2 or anti-anti-beta-actin). The detection was performed using ECL system and Hyperfilm. MTT assays showed a statistically significant reduction in cellular mitochondrial activity (p<0.001) probably attributed to an osmotic effect due to the use of 10% (V/V) concentration rather than 1% (V/V). The optical microscopy analysis revealed no significant morphological changes in MDCK and LLC-PK1 cells submitted to the different treatments when compared to controls groups. The WB analysis indicated a proportional increase in (Na++K+)-ATPase content according to an increase in the homeopathic stimuli. Although preliminary, these results show for the first time, that the homeopathic medicine is able to modify the expression of important physiological markers for LLC-PK1 cells, which are directly involved in the genesis of hypertension.(AU)

Avaliação da condutividade elétrica, pH e índice de refração como parâmetro físico-químico para controle de altas diluições de aveloz, em farmácias homeopáticas / Evaluation of electrical conductivity, pH and refractive index as physico-chemical parameters for quality control of Aveloz homeopathic solutions

Euphorbia tirucalli Lineu (aveloz) pertence à família Euphorbiaceae e é usada no tratamento do câncer e de verrugas. Alguns trabalhos têm evidenciado que os ésteres de forbol são os princípios ativos responsáveis pela atividade antitumoral do aveloz. A produção destas moléculas ocorre em maior quantidade no mês de maio, durante o período da manhã. O presente estudo teve como objetivo avaliar se os parâmetros físico-químicos de soluções aquosas ultradiluídas e dinamizadas (SUDs) de aveloz, como: pH, condutividade elétrica e índice de refração se alteram devido ao tempo de estocagem. As SUDs foram preparadas seguindo método de trituração em lactose e posterior solubilização em meio aquoso, como descrito na Farmacopéia Homeopática Brasileira 2ª Edição, utilizando como insumo de partida o látex coletado da planta no mês de maio. SUDs contendo apenas lactose foram preparadas e avaliadas igualmente àquelas contendo aveloz, como grupo controle. As potências que foram submetidas às análises de condutividade elétrica, pH e índice de refração foram: 4CH, 7CH, 9CH, 12CH, 14CH, 15CH, 29CH, 30CH. Como resultados, detectamos diferença estatisticamente significativa (p = 0,035) para os valores de condutividade elétrica obtidos de SUDs contendo apenas lactose em comparação as SUDs de aveloz, na potência 15CH. Verificamos também, que a condutividade elétrica de soluções aquosas dinamizadas aumenta com o envelhecimento das mesmas;entretanto, variações na condutividade elétrica não estão diretamente relacionadas com o pH ou o índice de refração das soluções, indicando que o processo de preparo das soluções pode modificar a condutividade elétrica das SUDs de maneira independente. A presença de gases no interior dos vidros que armazenam as SUDs parece influenciar a condutividade elétrica destas soluções. Para as medidas de pH e índice de refração nenhuma diferença estatisticamente significativa foi observada (p>0,05).(AU)

Physical chemical and citotoxic evaluation of highly diluted solutions of Euphorbia tirucalli L. prepared through the fifty milesimal homeopathic method / Avaliação físico-química e citotóxica de soluções altamente diluídas de euphorbia tirucalli l. Preparada pelo método cinqüenta milesimal (lm) / Evaluación físico-química y citotóxica de soluciones altamente diluídas de Euphorbia tirucalli L. preparadas por el método homeopático cincuenta milesimal (LM)

Motivação: Embora Hahnemann tenha descrito o método LM na 6ª. Edição do Organon da Arte de Curar, poucas pesquisas tem sido feitas sobre as propriedades físico-químicas destas preparações. Além disso, ainda não existem evidências que apontem para a correlação entre propriedades físico-químicas e os efeitos biológicos das altas diluições. Objetivos: determinar características físico-químicas das preparações LM tais como condutividade elétrica, pH e índice de refração, bem como o efeito biológico em modelos experimentais. Materiais e Métodos: foi analisada uma série de diluições desde 1 lm até 10 lm de Euphorbia tirucalli L., preparada a partir do látex e do suco da planta. Para considerar as características sazonais desta planta, usamos 2 populações diferentes, colhidas uma em Junho de 2007 e outra em Maio de 2008. Além disso, o efeito citotóxico da Euphorbia tirucalli L. 5 lm foi testado em células humanas cancerosas (MCF7) através de ensaio MTT. Conclusões: Algumas diferenças entre as duas populações foram observadas. No entanto, nenhuma correlação clara pode ser observada entre as propriedades físico-químicas e a atividade biológica.(AU)

Background: although Hahnemann described the fifty-milesimal (LM) method in the 6th edition of the Organon of the Medical Art, very little research has been carried out on the physical chemical properties of these homeopathic preparations. Furthermore, there is still no evidence allowing for the correlation between the alleged physical chemical properties and the biological effects of high dilutions. Aims: to evaluate physical chemical characteristics of LM preparations including electrical conductivity, pH and refraction index, and their effect on biological experimental models. Materials and methods: preparations tested for physical chemical analysis were dilutions 1 lm to 10 lm of Euphorbia tirucalli L. prepared from the latex and the juice of the plant. To rule the seasonal characteristics of this plant, 2 different populations were used, one collected in June 2007 and the other in May 2008. Furthermore, the cytotoxic effect of Euphorbia tirucalli 5 lm was tested on human breast cancer cells (MCF7) through MTT assay. Conclusions: Some differences among the two collections were observed. However, any clear correlation could be observed between physical chemical properties and biological activity.(AU)

Motivación: Aunque Hahnemann describió el métodocincuenta milesimal (LM) en la 6 ª edición del Organon del Arte Médica, muy poca investigación se ha realizado sobre las propiedades físico-químicas de estos preparados homeopáticos. Por otra parte, todavía no hay pruebas que permitan la correlación entre las presuntas propiedades físico-químicas y los efectos biológicos, de las altas diluciones. Objetivos: evaluar las características físico-químicas de los preparados LM, incluyendo conductividad eléctrica, pH y el índice de refracción, y su efecto en modelos biológicos experimentales. Materiales y métodos: las muestras para el análisis físico-químico fueron diluciones 1 a 10 lm de Euphorbia tirucalli L. preparadas a partir del látex y el jugo de la planta. Para descartar las características sazonales de esta planta, dos poblaciones diferentes fueron utilizadas, una recogida en junio de 2007 y otro en mayo de 2008. Además, el efecto citotóxico de Euphorbia tirucalli 5 lm fue probado en células humanas de cáncer de mama (MCF7) a través del ensayo MTT. Conclusiones: Algunas diferencias entre las dos colecciones se observaron. Sin embargo, ninguna correlación clara se observó entre las propiedades físicas- químicas y actividad biológica.(AU)

Physical chemical and citotoxic evaluation of highly diluted solutions of Euphorbia tirucalli L. prepared through the fifty milesimal homeopathic method / Avaliação físico-química e citotóxica de soluções altamente diluídas de euphorbia tirucalli l. Preparada pelo método cinqüenta milesimal (lm) / Evaluación físico-química y citotóxica de soluciones altamente diluídas de Euphorbia tirucalli L. preparadas por el método homeopático cincuenta milesimal (LM)

Motivação: Embora Hahnemann tenha descrito o método LM na 6ª. Edição do Organon da Arte de Curar, poucas pesquisas tem sido feitas sobre as propriedades físico-químicas destas preparações. Além disso, ainda não existem evidências que apontem para a correlação entre propriedades físico-químicas e os efeitos biológicos das altas diluições. Objetivos: determinar características físico-químicas das preparações LM tais como condutividade elétrica, pH e índice de refração, bem como o efeito biológico em modelos experimentais. Materiais e Métodos: foi analisada uma série de diluições desde 1 lm até 10 lm de Euphorbia tirucalli L., preparada a partir do látex e do suco da planta. Para considerar as características sazonais desta planta, usamos 2 populações diferentes, colhidas uma em Junho de 2007 e outra em Maio de 2008. Além disso, o efeito citotóxico da Euphorbia tirucalli L. 5 lm foi testado em células humanas cancerosas (MCF7) através de ensaio MTT. Conclusões: Algumas diferenças entre as duas populações foram observadas. No entanto, nenhuma correlação clara pode ser observada entre as propriedades físico-químicas e a atividade biológica.

Background: although Hahnemann described the fifty-milesimal (LM) method in the 6th edition of the Organon of the Medical Art, very little research has been carried out on the physical chemical properties of these homeopathic preparations. Furthermore, there is still no evidence allowing for the correlation between the alleged physical chemical properties and the biological effects of high dilutions. Aims: to evaluate physical chemical characteristics of LM preparations including electrical conductivity, pH and refraction index, and their effect on biological experimental models. Materials and methods: preparations tested for physical chemical analysis were dilutions 1 lm to 10 lm of Euphorbia tirucalli L. prepared from the latex and the juice of the plant. To rule the seasonal characteristics of this plant, 2 different populations were used, one collected in June 2007 and the other in May 2008. Furthermore, the cytotoxic effect of Euphorbia tirucalli 5 lm was tested on human breast cancer cells (MCF7) through MTT assay. Conclusions: Some differences among the two collections were observed. However, any clear correlation could be observed between physical chemical properties and biological activity.

Motivación: Aunque Hahnemann describió el métodocincuenta milesimal (LM) en la 6 ª edición del Organon del Arte Médica, muy poca investigación se ha realizado sobre las propiedades físico-químicas de estos preparados homeopáticos. Por otra parte, todavía no hay pruebas que permitan la correlación entre las presuntas propiedades físico-químicas y los efectos biológicos, de las altas diluciones. Objetivos: evaluar las características físico-químicas de los preparados LM, incluyendo conductividad eléctrica, pH y el índice de refracción, y su efecto en modelos biológicos experimentales. Materiales y métodos: las muestras para el análisis físico-químico fueron diluciones 1 a 10 lm de Euphorbia tirucalli L. preparadas a partir del látex y el jugo de la planta. Para descartar las características sazonales de esta planta, dos poblaciones diferentes fueron utilizadas, una recogida en junio de 2007 y otro en mayo de 2008. Además, el efecto citotóxico de Euphorbia tirucalli 5 lm fue probado en células humanas de cáncer de mama (MCF7) a través del ensayo MTT. Conclusiones: Algunas diferencias entre las dos colecciones se observaron. Sin embargo, ninguna correlación clara se observó entre las propiedades físicas- químicas y actividad biológica.